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BioTNT Preci® qPCR 引物
BioTNT 推出 Preci® qPCR 引物对(protein coding)---其中human 共20608套,mouse 引物26284套,rat 引物23288套经验证QPCR PCR 引物对;
内参基因引物(beta actin,GAPDH, 18SRNA等);
BioTNT提供Preci® qPCR引物
BioTNT公司精准引物产品(Precise Primer Pair)从NCBI获取全球全新的生物核酸序列,精确提供目标基因的SYBR® Green qPCR检测引物,备有大量库存的引物、阳性模板以及相关试剂。
 
BioTNT 设计的qPCR引物,是以基因ID 为特征的,尽量采用多个转录本(transcript/变异体)相同区段进行设计的引物;并经qPCR 实验验证,熔解曲线峰单一;
BioTNT 设计的引物,不保证是跨外显子的,您进行实验时,要注意,去除基因组污染,从而才能得到准确的表达的实验数据;
 
什么是基因的转录本:
基因的转录本,也被称为Transcript Variant或剪切体,是由一条基因通过转录形成的一种或多种可供编码蛋白质的成熟的mRNA。以下是关于转录本的详细解释:
  1. 形成过程:基因在转录之后,首先形成前体mRNA。这个前体mRNA会经过一系列的处理,包括剪掉内含子(intron)并连接外显子(exon),同时在5’端加上帽子结构,3’端加上尾巴结构,从而形成成熟的mRNA,即转录本。
  2. 剪接方式:在形成转录本的过程中,可能会由于不同的剪接方式而产生多种转录本。这些剪接方式可能包括剪切掉部分外显子,或者保留部分内含子等。因此,一个基因有可能对应多个转录本。
  3. 功能与意义:每个转录本都可能编码产生不同的蛋白质,从而赋予基因多种不同的功能。例如,有些基因可以编码多达98条转录本,这意味着这些基因可能具有非常复杂的生物学功能。
  4. 研究价值:转录本的研究对于理解基因的功能和调控机制具有重要意义。通过设计转录本实验,可以研究内含子剪切机制、表观遗传、RNA编辑等生物学过程。此外,转录本的研究还有助于考察一条基因对应的不同转录本的调节机制等。
综上所述,转录本是由基因通过转录形成的一种或多种可供编码蛋白质的成熟的mRNA。其形成过程涉及复杂的剪接方式,每个转录本都可能编码产生不同的蛋白质,从而赋予基因多种不同的功能。转录本的研究对于理解基因的功能和调控机制具有重要意义。
全转录本引物设计的重要性:
NCBI 数据库里(截止2024年6月),关于人/大鼠/小鼠,共有22243个基因是单转录本,有43866个基因是多于1个转录本的,需要进行同源性比对;
下面是截屏:在这30个基因中, 仅有2 个基因是单转录本的,不需要做转录本同源性比对的;
NCBI GeneID Symbol Description 特异性种属 Transcripts
7157 TP53 tumor protein p53 human(人) 26
1956 EGFR epidermal growth factor receptor human(人) 13
7124 TNF tumor necrosis factor human(人) 1
348 APOE apolipoprotein E human(人) 5
7422 VEGFA vascular endothelial growth factor A human(人) 20
3569 IL6 interleukin 6 human(人) 6
7040 TGFB1 transforming growth factor beta 1 human(人) 3
4524 MTHFR methylenetetrahydrofolate reductase human(人) 20
2064 ERBB2 erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 human(人) 33
3091 HIF1A hypoxia inducible factor 1 subunit alpha human(人) 3
2099 ESR1 estrogen receptor 1 human(人) 55
3586 IL10 interleukin 10 human(人) 4
351 APP amyloid beta precursor protein human(人) 11
1636 ACE angiotensin I converting enzyme human(人) 9
672 BRCA1 BRCA1 DNA repair associated human(人) 368
6774 STAT3 signal transducer and activator of transcription 3 human(人) 27
4318 MMP9 matrix metallopeptidase 9 human(人) 1
1401 CRP C-reactive protein human(人) 4
3845 KRAS KRAS proto-oncogene, GTPase human(人) 6
627 BDNF brain derived neurotrophic factor human(人) 17
673 BRAF B-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase human(人) 25
9370 ADIPOQ adiponectin, C1Q and collagen domain containing human(人) 2
367 AR androgen receptor human(人) 6
207 AKT1 AKT serine/threonine kinase 1 human(人) 20
5243 ABCB1 ATP binding cassette subfamily B member 1 human(人) 4
3123 HLA-DRB1 major histocompatibility complex, class II, DR beta 1 human(人) 6
4790 NFKB1 nuclear factor kappa B subunit 1 human(人) 17
7421 VDR vitamin D receptor human(人) 10
3553 IL1B interleukin 1 beta human(人) 3
1029 CDKN2A cyclin dependent kinase inhibitor 2A human(人) 15
 
 
Preci® qPCR 引物说明书参数示意图:
 
   BioTNT Preci®产品解决方案
 
l  经验证的Preci®引物对;
l Real time PCR (Sybrgreen)引物,一套引物分成两管包装,上游引物管壁上标注货号+f, 下游引物管壁标注货号+r。每管200ul,浓度为10uM。-20℃可长期保存;
l 引物为Page 纯化,可用于qPCR 实验;
l 引物可以用统一的qPCR 两步法
l  高特异性和灵敏度:低非特异性结合的理想之选,目标基因序列的100%匹配以及强的初始扩增信号;
l  可重复的结果:严格的QC要求确保每批次都具有一致的性能;
l  可靠的产品质量:公司实验室平行实验使用引物,控制引物使用风险;
l  对数据充满自信:每种引物通过阳性模板验证,确认实验数据真实可靠;
 
 

  BioTNT 生物技术服务部积累多年的引物设计服务经验,现推出BioTNT 引物定制服务。

 

  1. 人/大鼠/小鼠 protein coding gene 引物为目录引物;提供基因ID 即可提供引物产品;
  2. 人/大鼠/小鼠 miRNA 引物均为目录引物,提供microRNA 名称即可提供引物试剂盒产品以及Qpcr 检测试剂盒产品;

以下提供定制引物,推荐小程序下单,可以直接填写表单进行定制:

  1. Preci®custom引物对,人/大鼠/小鼠小程序搜索不到的,都可以小程序下单;

Preci®custom 引物对;
货号:PRIM1P;
规格:200ul*10um*2
客户必填
填写表单可以下单;
表单内容:
在biotnt 官网可以搜索到所有protein coding 引物的基因ID信息并下单;

  1. 普通定制引物:

货号:cust-其他引物
规格:200ul*10um*2

针对以下场景,请选择BioTNT 普通定制引物:

  • 针对客户提供的已知特定序列;
  • 除了人,大鼠,小鼠三个种属之外的其他种属的mRNA 基因序列;
  • 人,大鼠,小鼠三个种属的mRNA 基因序列的特殊指定位置;
  • 可以设计qPCR 引物或者普通电泳引物两种类型;

 

  1. lncRNA qPCR 引物定制

货号: cust-lncRNAp
规格: 200ul*10um*2
客户必填:种属(可选)、基因信息编号、数据库(可选);
客户可填:备注;
lncRNA的序列查找,引物设计和实验方案推荐:
BioTNT 的lncRNA引物设计验证服务
(一)序列查找;
ncbi 查找lncRNA序列;
ensemble 查找lncRNA 序列;
(二)序列比对:
把查找到lncRNA 序列在ncbi blast 里面进行序列比对;
要求:设计的区段必须是特异的区段;
由于ensemble 数据库与ncbi 数据库的不统一,会出现很多难以确认的序列,需要与客户进行沟通确认;
不能确认的序列就不能设计了;
找不到特异的大约200bp 左右的序列片段,原则上也不能进行设计;比较短的特异性序列,建议客户可以更改探针法进行设计;
(三)引物设计的原则:
找到特异性序列,就要进行设计了;设计好的序列再进行RNA 序列和基因组序列的比对;
由于lncRNA 通常表达量很少,所以为了排除引物的原因,我们推荐在同一个外显子内进行设计,这样设计出来的引物可以用基因组样本进行验证;
引物设计还应该符合qPCR 的其他原则,如引物长度,产物长度,TM 值,退火温度;引物二级结构良好等特点,在oligo软件中进行引物结构分析;
(四)引物特异性比对:
请选用同种属的基因组序列和RNA 序列对引物进行特异性比对;良好的引物应该符合特异性要求;
(五)设计的原则
引物合成验证:
引物采用Page 纯化,合成后引物应该进行qPCR 实验验证,模板采用基因组DNA 的模板进行验证,得到的产物扩增曲线S 型,熔解曲线单峰,且TM 与引物设计的TM 值相差不超过2度;
 
(六)提供产品:
提供两支引物,上下游,浓度为10um,体积为200ul,采用标准的qPCR 两步退火方式;可以进行500T的检测;
客户需要准备的:
(一)样本是否需要去除基因组:
由于lncRNA的序列我们采用了同一个外显子的设计方式,所以扩增产物可以在基因组上找到,所以如果想要得到准确的表达结果,样本中应该进行基因组的去除处理,可以在抽提的时候进行基因组去除,也可以在逆转录的时候进行基因组去除;
您也可以同时抽提一些含基因组的样本,用于引物的验证;
(二)RNA抽提方法:
尽量采用抽提总RNA 方法进行抽提;
(三)逆转录方式:
当然,如果要检测lncRNA,由于序列不存在poly A 尾,所以在抽提了RNA, 进行逆转录时,请选择用随机引物逆转录,或者用特异性引物进行逆转录;
所以,抽提的RNA,用mRNA 的oligodT+随机引物的逆转录方式,也是可以检测lncRNA 的;
(四)内参选择:
根据抽提的方式和样本的情况,如果是抽提总RNA的,可以用GAPDH,actb作为内参。
 
LncRNA 引物定制下单的表单:
需要填写:种属,基因信息编号,数据库;以及备注
 
 

 

  1. Chip qPCR 引物定制(定位设计)  cust-Chipp

货号:cust-Chipp
规格:200ul*10um*2
客户必填:种属(可选)、基因名称、基因ID、定位信息;
客户可填:备注;
 
Chip qpCR定位设计:
1).查找该基因的启动子区域;
2).客户指定设计区段,或者设计位点,我们设计qpCR引物;
3).合成引物,在基因组DNA上验证,提供客户相应的引物;


 

  1. Chip qPCR 引物定制(分段设计)4套

货号:cust-Chipp
规格:200ul*10um*2*4
Chip qpCR分段设计:
客户必填:种属(可选)、基因ID、基因名称;
客户可填:备注;
 
 
1).查找该基因的启动子区域;一般位2000bp
2).根据2000bp,进行分段设计,一般为1-500,501-1000,1001-1500,1501-2000四个区段,尽量设计在每个区段的中部,引物长度为60-150bp,符合qPCR引物设计原则;设计好的引物用primer blast进行比对保证异性;
3).合成引物,在基因组DNA上验证,提供客户相应的引物;
4).引物计算TM值与验证TM值接近,通过特异性验证的方向提供给客户;
5).提供给客户的产品为200ul*2(浓度为10um)的四套产品;


 
 

 

  1. pri-miRNA 引物定制

货号:cust-pri
规格:500T
客户必填:种属(可选)、名称;
客户可填:备注;

  1. pre-miRNA 引物定制

货号:cust-pre
规格:500T
客户必填:种属(可选)、名称;
客户可填:备注;
 
 
Pre-miRNA 和pri-miRNA的序列查找,引物设计和实验方案推荐
BioTNT 的引物设计验证服务
(一)序列查找;
ncbi 查找Pre-miRNA序列;
而pri-miRNA 的序列呢,则是pre 序列的扩展序列;
这是右侧的序列起始,我们可以根据这个序列,向上和向下进行扩展(先各扩展50bp);
扩展后得到的就是pri microRNA 的序列;


(二)引物设计:
根据这个序列,就要进行设计了;当然这个序列的设计也是有技巧的,最重要的原则是:Pre 和Pri 要能够区分;
引物Pri 序列中是包含Pre 序列的,所以我们设计时,总不能Pri 的序列设计出来, Pre 的序列也能扩出来;
所以我们把Pri 序列分为3个部分,分别为1(5‘端扩展序列),2(pre 序列),3(3‘端扩展序列);所以,上游引物的位置和下游引物的位置,这几种搭配是可以的:
1+2;2+3;1+3;
引物设计还应该符合qPCR 的其他原则,如引物长度,产物长度,TM 值,退火温度;引物二级结构良好等特点,在oligo软件中进行引物结构分析;
(三)引物特异性比对:
请选用同种属的基因组序列对引物进行特异性比对;良好的引物应该符合特异性要求;
(四)引物合成验证:
引物采用Page 纯化,合成后引物应该进行qPCR 实验验证,模板采用基因组DNA 的模板进行验证,得到的产物扩增曲线S 型,熔解曲线单峰,且TM 与引物设计的TM 值相差不超过2度;
 
(五)提供产品:
提供两支引物,上下游,浓度为10um,体积为200ul,采用标准的qPCR 两步退火方式;可以进行500T的检测;
客户需要准备的:
(一)样本是否需要去除基因组:
由于pre-miRNA的序列和pri-miRNA 序列都可以在基因组上找到,所以如果想要得到准确的表达结果,样本中应该进行基因组的去除处理,可以在抽提的时候进行基因组去除,也可以在逆转录的时候进行基因组去除;
(二)RNA抽提方法:
尽量采用抽提总RNA 方法进行抽提;这个和microRNA 不同,microRNA 可以采用专门抽提的方式或者总RNA 抽提方式,不能采用仅使用mRNA的抽提方式;
(三)逆转录方式:
当然,如果要检测Pre-miRNA,由于序列不存在poly A 尾,所以在抽提了RNA, 进行逆转录时,请选择用随机引物逆转录,或者用特异性引物进行逆转录;
pri-miRNA 的逆转录方式,也是同上面的;
所以,抽提的RNA,用mRNA 的oligodT+随机引物的逆转录方式,也是可以检测PremicroRNA 和PrimicroRNA的;
这个和microRNA 的检测采用茎环法逆转录也是不同的;
(四)内参选择:
根据抽提的方式和样本的情况,如果是抽提总RNA的,可以用GAPDH,actb作为内参。

  1. gRNA定制服务

货号:cust-gRNA
产品类型:质粒、慢病毒
产品规格:三对gRNA(gRNA*3)、三合一(3gRNA all in one)
客户必填:种属、基因名称、基因ID;
客户可填:备注;
 
 


普通PCR 和 qPCR 引物的设计原则有相同也有不同;

 

相同处:

         序列的查找是一致的;

         序列选取应在基因的保守区段;

         选取合适的扩增片段大小

         避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对;

         避免引物自身形成环状发卡结构;

         Tm值在55-65℃,GC含量在40%-60%;

         引物之间的TM相差避免超过2℃;

         引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基;

 

不同处:

       Real time PCR 引物

         PCR 产物长度;real-time PCR要求在300bp以内,一般首选80-150bp 之间;

         多对目的基因同时扩增,文献上查来的引物条件会不同,需要设计尽可能条件一致的引物;

         目的基因含量比较低时,需要设计灵敏度比较高的引物;

         相对电泳法,Real time PCR灵敏度比较高,对引物的要求更高,引物二聚体要少;熔解曲线要求单一产物;

         Real time PCR的目的是进行定量或者相对定量,对扩增的效率有要求;对引物的二级结构要求高;

 

普通PCR 引物:

         根据实验的要求不同,长度一般是从150bp到几千bp 不等;

         对二级结构要求没有real time PCR 高;

         对扩增效率要求不高;

         可以选用梯度PCR 仪,选择不同退火温度,对引物退火温度要求不需要一致;

 

验证时不同:

 

引物的特异性(相同点):

Ø       引物的特异性在使用前用blast 来保证;

 

不同点:real time PCR

Ø       在实验结果中通过熔解曲线来验证;

Ø        PCR的特异性产物峰应与引物报告中的PCR product 相差在两度之内;

 

普通PCR 通过产物的长度,跑条带,来鉴别产物的特异性;

 

Real time PCR 可以通过扩增曲线,熔解曲线分析来鉴别产物的相对量,同时也可以对终产物进行电泳分析,更全面,更科学!


 

1、Q:引物序列什么时候提供?
A:引物序列一般是在付款后提供,提供方式见如下:
 
2、Q:  引物扩增的特异性如何保证?
    A:   实验验证时,我们的引物一般是用tm 值来确认的;
方式:如下是我们示例的融解曲线,峰的位置是在80.4度;
这先是我们通过oligo 计算出来的理论值,也是在仪器上验证过的;
但不同仪器,不同mix 在仪器上会有所差异,一般差异不超过2度,都可能是正确的;但所有的差异都应该是同一个方向上的;
关于一般建议的验证方式顺序是:
a、TM 验证;(Biotnt 验证)
b、跑胶长度验证;(客户自己进行,请注意不要导致实验室污染)
c、测序验证(测序一般来讲,会有部分前后序列测不准,所以如果您要进行测序验证的话,产物长度一般要大于100bp)(客户自己进行)
 
 
3、Q:QPCR的引物长度一般是多少?
     A: 关于扩增产物长度:biotnt 一般控制在150bp 之内;这样比较合适做QPCR,特别是两步法的扩增;
 
 
 
4、Q: 引物的扩增效率是多少?
    A: Biotnt 引物是设计两对,我们挑选其中比较优的一对给您;
        对于扩增效率,您需要自己去验证;一般扩增效率的验证有两种方法:
        标准曲线法;或者是很多仪器自己有导出的;
       这个我们不提供;
     我们提供给您的引物,是两对引物中扩增效率比较优的一对;
     简单 的delta delta CT 法,可以比较引物扩增曲线对数曲线的斜率,如果斜率平行,就可以使用delta delta CT 法进行实验和计算;
    如果斜率不平行,可以使用相对定量的标准曲线法;
 
5、 Q: Biotnt 引物提供的浓度是多少?
        A:BioTNT 为了方便客户使用,提供的引物浓度为2umol/l, 在终反应体系里是10*的浓度,即20ul 体系中,上游引物加入2ul,下游引物加入2ul。
 
6、Q:引物序列提供后,我如果想知道引物的特异性,该如何进行blast?
 
 

问题

解决

样本没有检测

核对您的样本种属和基因名称,样本种属有特异性;

杂乱的熔解曲线

检查样本内参CT 值,目的基因CT 值:如果样本内参CT 值比较高,目的基因CT 值也比较高,说明样本质量不好,建议更换样本;

如果内参CT 值正常,目的CT 值比较高,熔解曲线杂乱是正常的,说明:可能没有input 目的RNA; 更换阳性样本进行检测;

熔解曲线峰与BioTNT mRNA引物产品说明书中提供的tm值不一致

使用biotnt premix,目的产物峰应与引物说明书的Tm 相差不超过两度;如果相差比较大,说明产物不对,建议更换样本或者更换premix

熔解曲线峰双峰:在目的产物峰左侧75度左右有一个产物

75度的峰为引物二聚体峰:CT 值大于33时,出现引物二聚体峰,是正常的;如果CT值低于33,出现引物二聚体和产物的双峰,建议更换biotnt premix 或者更换引物。

熔解曲线峰双峰:在目的产物峰右侧有一个产物峰

可能为基因组DNA 产物峰;由于biotnt 为验证过的引物(用biotnt QPCR premix验证),如果样本质量不合格,含有基因组污染,则当引物为跨外显子检测时,部分样本会在目的产物峰右侧出现一个峰(显示样本含有基因组污染),建议重新提取样本或对样本进行DNase 处理;

 

引物售后:请提供以下实验数据发送到biotnt@biotnt.com,并抄送给相应的销售;

建议客户使用引物进行实验时设定RNA阴性对照;

设定对照的方式:样本1数据(目的+内参),阴性水样本数据(目的);设定样本RNA阴性对照(样本的RNA,按照逆转录的稀释比进行稀释),同样做QPCR, 看样本是否存在该基因的基因组污染。

 

 

 
 
技术支持:[email protected]    产品咨询:[email protected]    售后服务群:47468567
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1. 搜索产品时先要选择搜索条件:品名搜索和货号搜索,搜索到产品列表时,可根据产品类别和品牌进行一次筛选;
2. 由于某些产品的英文名较多,可更换关键词搜索;
3. 当进行品名搜索时,切勿将品名和种类同时输入,否则就有可能搜索不到产品(例如:FAST Frame for Chip Kits - 4 Slide frame 生物芯片,将有可能搜索不到产品或者过多的产品);
4. 如果您需求的产品比较急时,可联系在线客服,即时为您提供更便捷的服务。