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BioTNT Preci® mRNA qPCR 引物
Preci®引物对

BioTNT现提供Preci®引物对

BioTNT公司精准引物产品(Precise Primer Pair)从NCBI获取全球最全最新的生物核酸序列,精确提供目标基因的SYBR® Green qPCR检测引物,备有大量库存的引物、阳性模板以及相关试剂,如定制的项目如仅需1周生成引物。

 

 

BioTNT全面引物产品解决方案

l  特色产品

l  经验证的Preci®引物对

l  高特异性和灵敏度:低非特异性结合的理想之选,目标基因序列的100%匹配以及最强的初始扩增信号

l  可重复的结果:严格的QC要求确保每批次都具有一致的性能

l  可靠的产品质量:公司实验室平行实验使用引物,控制引物使用风险

l  对数据充满自信:每种引物通过阳性模板验证,确认实验数据真实可靠

 

 

研究用引物

针对mRNA、microRNA、lncRNA、基因组DNA、质粒DNA提供超过20多万种引物及相关试剂

l  查看mRNA用引物

l  查看microRNA用引物

l  查看lncRNA用引物

l  查看基因组DNA、质粒DNA用引物

 

 

针对SYBR® Green qPCR、PCR array、普通PCR、SNP、ChIP提供多用途引物及相关试剂

l  查看SYBR® Green qPCR用引物

l  查看PCR array用引物

l  查看普通PCR用引物

l  查看SNP用引物

l  查看ChIP用引物

 

 

定制引物产品;

拥有 30 年定制引物生产专业知识,包括基因查找比对、转录本确认、大规模引物设计、批量引物生产以及下游处理。

了解定制引物产品

 

l  引物浓度:2μM

l  引物包装:上游引物,下游引物各一支

l  储存温度:-20℃

 

 

配套试剂
RNA 抽提试剂盒 逆转录试剂盒 Real time PCR 试剂盒 Premix


普通PCR 和 qPCR 引物的设计原则有相同也有不同;

 

相同处:

         序列的查找是一致的;

         序列选取应在基因的保守区段;

         选取合适的扩增片段大小

         避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对;

         避免引物自身形成环状发卡结构;

         Tm值在55-65℃,GC含量在40%-60%;

         引物之间的TM相差避免超过2℃;

         引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基;

 

不同处:

       Real time PCR 引物

         PCR 产物长度;real-time PCR要求在300bp以内,一般首选80-150bp 之间;

         多对目的基因同时扩增,文献上查来的引物条件会不同,需要设计尽可能条件一致的引物;

         目的基因含量比较低时,需要设计灵敏度比较高的引物;

         相对电泳法,Real time PCR灵敏度比较高,对引物的要求更高,引物二聚体要少;熔解曲线要求单一产物;

         Real time PCR的目的是进行定量或者相对定量,对扩增的效率有要求;对引物的二级结构要求高;

 

普通PCR 引物:

         根据实验的要求不同,长度一般是从150bp到几千bp 不等;

         对二级结构要求没有real time PCR 高;

         对扩增效率要求不高;

         可以选用梯度PCR 仪,选择不同退火温度,对引物退火温度要求不需要一致;

 

验证时不同:

 

引物的特异性(相同点):

Ø       引物的特异性在使用前用blast 来保证;

 

不同点:real time PCR

Ø       在实验结果中通过熔解曲线来验证;

Ø        PCR的特异性产物峰应与引物报告中的PCR product 相差在两度之内;

 

普通PCR 通过产物的长度,跑条带,来鉴别产物的特异性;

 

Real time PCR 可以通过扩增曲线,熔解曲线分析来鉴别产物的相对量,同时也可以对终产物进行电泳分析,更全面,更科学!


 

1、Q:引物序列什么时候提供?
A:引物序列一般是在付款后提供,提供方式见如下:
 
2、Q:  引物扩增的特异性如何保证?
    A:   实验验证时,我们的引物一般是用tm 值来确认的;
方式:如下是我们示例的融解曲线,峰的位置是在80.4度;
这先是我们通过oligo 计算出来的理论值,也是在仪器上验证过的;
但不同仪器,不同mix 在仪器上会有所差异,一般差异不超过2度,都可能是正确的;但所有的差异都应该是同一个方向上的;
关于一般建议的验证方式顺序是:
a、TM 验证;(Biotnt 验证)
b、跑胶长度验证;(客户自己进行,请注意不要导致实验室污染)
c、测序验证(测序一般来讲,会有部分前后序列测不准,所以如果您要进行测序验证的话,产物长度一般要大于100bp)(客户自己进行)
 
 
3、Q:QPCR的引物长度一般是多少?
     A: 关于扩增产物长度:biotnt 一般控制在150bp 之内;这样比较合适做QPCR,特别是两步法的扩增;
 
 
 
4、Q: 引物的扩增效率是多少?
    A: Biotnt 引物是设计两对,我们挑选其中比较优的一对给您;
        对于扩增效率,您需要自己去验证;一般扩增效率的验证有两种方法:
        标准曲线法;或者是很多仪器自己有导出的;
       这个我们不提供;
     我们提供给您的引物,是两对引物中扩增效率比较优的一对;
     简单 的delta delta CT 法,可以比较引物扩增曲线对数曲线的斜率,如果斜率平行,就可以使用delta delta CT 法进行实验和计算;
    如果斜率不平行,可以使用相对定量的标准曲线法;
 
5、 Q: Biotnt 引物提供的浓度是多少?
        A:BioTNT 为了方便客户使用,提供的引物浓度为2umol/l, 在终反应体系里是10*的浓度,即20ul 体系中,上游引物加入2ul,下游引物加入2ul。
 
6、Q:引物序列提供后,我如果想知道引物的特异性,该如何进行blast?
 
 

问题

解决

样本没有检测

核对您的样本种属和基因名称,样本种属有特异性;

杂乱的熔解曲线

检查样本内参CT 值,目的基因CT 值:如果样本内参CT 值比较高,目的基因CT 值也比较高,说明样本质量不好,建议更换样本;

如果内参CT 值正常,目的CT 值比较高,熔解曲线杂乱是正常的,说明:可能没有input 目的RNA; 更换阳性样本进行检测;

熔解曲线峰与BioTNT mRNA引物产品说明书中提供的tm值不一致

使用biotnt premix,目的产物峰应与引物说明书的Tm 相差不超过两度;如果相差比较大,说明产物不对,建议更换样本或者更换premix

熔解曲线峰双峰:在目的产物峰左侧75度左右有一个产物

75度的峰为引物二聚体峰:CT 值大于33时,出现引物二聚体峰,是正常的;如果CT值低于33,出现引物二聚体和产物的双峰,建议更换biotnt premix 或者更换引物。

熔解曲线峰双峰:在目的产物峰右侧有一个产物峰

可能为基因组DNA 产物峰;由于biotnt 为验证过的引物(用biotnt QPCR premix验证),如果样本质量不合格,含有基因组污染,则当引物为跨外显子检测时,部分样本会在目的产物峰右侧出现一个峰(显示样本含有基因组污染),建议重新提取样本或对样本进行DNase 处理;

 

引物售后:请提供以下实验数据发送到biotnt@biotnt.com,并抄送给相应的销售;

建议客户使用引物进行实验时设定RNA阴性对照;

设定对照的方式:样本1数据(目的+内参),阴性水样本数据(目的);设定样本RNA阴性对照(样本的RNA,按照逆转录的稀释比进行稀释),同样做QPCR, 看样本是否存在该基因的基因组污染。

 

 

 
 
技术支持:[email protected]    产品咨询:[email protected]    售后服务群:47468567
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